熒光定量PCR試劑盒熔解曲線出現多峰的原因及解決方法介紹

　　熒光定量PCR是目前分子生物學研究中常使用的技術手段之一，熒光定量PCR試劑盒反應特異性高，能有效避免非特異擴增，提高實驗效率。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。

 

　　下面咱們來了解下熒光定量PCR試劑盒熔解曲線出現多峰的原因及解決方法：

 

　　較為理想的熔解曲線是單峰曲線，如出現多峰有以下原因：

 

　　1、非特異性擴增：主要原因為引物特異性不好、Tm值較低或模板質量不高，可以根據設計原則設計新引物或者通過梯度PCR對引物退火溫度（Tm值）進行優化，上調Tm值，選購質量較好的離心柱法核酸提取試劑，提高核酸提取質量，等等。

 

　　2、引物二聚體可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位于100bp以下。引物二聚體在熔解曲線內峰值一般位于75℃左右，如該峰顯著請按照以下方面進行優化：

 

　?。?）優化擴增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索Tm值。通常兩步循環(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為60℃。

 

　?。?）引物濃度太高，適當降低引物濃度。通常引物的Tm低于目的基因，熔解曲線上峰值在目的基因峰的左邊。大多數情況下，每條引物的理想濃度為200nM，但如有需要，可將濃度降至60nM。

 

　?。?）cDNA模板帶有基因組DNA污染：重新制備cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase對RNA進行處理，然后逆轉錄為cDNA。

 

　　如果排除以上原因還是出現熔解曲線多峰的情況，就要考慮及時更換試劑盒，避免耽誤實驗進度。