一文與大家分享熒光定量PCR試劑盒的反應流程

　　熒光定量PCR試劑盒的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。進行檢測時，樣品中的受檢物質（抗原或抗體）與固定的抗體或抗原結合。通過洗板除去非結合物，再加入酶標記的抗原或抗體，此時，能固定下來的酶量與樣品中被檢物質的量相關。通過加入與酶反應的底物后顯色，根據顏色的深淺可以判斷樣品中物質的含量，進行定性或定量的分析。

 

　　今天要與大家分享的是熒光定量PCR試劑盒的反應流程，希望能夠幫助到您：

 

　　1、將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環。在每一個循環中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環。重復這樣的循環25～35次，使擴增的DNA片段大量累積。最后，在72℃保持3-7min，使產物延伸完整，4℃保存。

 

　　2、復性和延伸溫度

 

　　復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。

 

　　3、反應時間

 

　　變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。

 

　　4、循環次數

 

　　循環次數主要與模板的起始數量有關，在模板拷貝數為104～105數量級時，循環數通常為25～35次。